三阴性乳腺癌的多组学图谱全貌——亚型和治疗策略
GenomicandTranscriptomicLandscapeofTriple-NegativeBreastCancers:SubtypesandTreatmentStrategies
全文摘要
结合RNA测序、外显子组测序和基于芯片的拷贝数分析，该团队对来自复旦大学上海肿瘤中心的例原发性三阴性乳腺癌样本进行评估，最终绘制了全球最大的三阴性乳腺癌队列多组学图谱。作者基于mRNA数据，通过聚类的方法，将三阴性乳腺癌患者分为4种亚型，并探究每一亚型的多组学图谱、特异改变以及特异性的治疗靶点。其中：
(1)luminalA型（LAR,腔面雄激素受体型）:与雄激素受体信号途径有关，可以靶向雄激素受体进行内分泌治疗；ERBB2突变较高、CDKN2A丢失较多，故可以分别靶向ERBB2、CDK4/6治疗；
(2)免疫调节型（IM）：高免疫细胞浸润，可以采用免疫检查点抑制治疗，预后较好；
(3)基底样免疫抑制型(BLIS)：预后最差的亚型，上调细胞周期基因、DNA损伤修复基因；下调免疫反应基因；与HRD相关，高HRD评分患者预后较好、对DNA损伤化疗药反应较好；低HRD评分患者则需要加强化疗、严密观察疾病进展情况
(4)间质型(MES)：富含乳腺癌干细胞通路基因，表现出JAK/STAT3信号通路激活，故靶向CSC、STAT3的抑制剂可能使患者受益
背景介绍
?关于三阴性乳腺癌（TNBC）：肿瘤细胞不表达ER、PR、Her2受体，占乳腺癌肿瘤的10%-20%。TNBC常发生于年轻女性，肿瘤体积较大、恶性程度高，诊断时常常发生淋巴结转移，侵袭性强。TNBC较其他类型乳腺癌早期远处转移率高，5年预后差。化疗仍是TNBC的标准治疗方案，TNBC的靶向治疗还处于早期阶段。
?靶向治疗与基因组学研究现状：未筛选的病人接受靶向治疗，其临床收益有限。迄今为止，TNBC的基因组研究主要集中在转录组和拷贝数上，对TNBC的生物学基础了解十分有限，特别是基因组特征。虽然年TCGA囊括了乳腺癌研究包含+例TNBC，使用6种不同的技术平台，但缺乏正式的临床评估。
结果解读
纳入样本测序信息韦恩图
=（癌旁组织和正常样本外显子测序）+（CNA拷贝数变异）+（RNA测序）
Fig1：TNBC多组学全貌
Fig1A：病人信息概览：mRNA亚型；intrinsic亚型；ASCATploidy（等位基因特异性的拷贝数分析倍性)ASCATpurity；HRDscore（同源重组缺陷评分）；手术时年龄;腺体分化;复发/转移。在不同mRNA亚型之间，进行统计量统计学检验：**p0.01，*p0.05）(固有亚型、ASCAT倍性、淋巴结状态—卡方检验；ASCAT纯度、HRDscore—K-W检验；手术时的年龄—方差检验；腺体分化。体细胞突变采用fisher检验。
HRDscore：HRD得分（Timms基于拷贝数生物标志提出）与BRCA1/2突变失活有显著相关性，便于识别从DNA损伤剂治疗中获益的患者
Fig1B：突变分析:其中TP53突变率最高。
PIK3CA,PTEN和PIK3R1突变与LAR亚型强相关。HRAS和ERBB2(即HER2，下文中统一使用HER2)突变频率低（2%），但它们与LAR相关。在LAR组中，总共有5个HER2突变。
Fig1C:评估体细胞拷贝数变异
方法：检测出现在GISTIC峰的原癌基因和抑癌基因（residualq1×10-4，残差q值指的是去除扩增或者缺失重叠峰区后的q值，使得在同一染色体上的峰区更有显著意义）。
（注释：deletion:-2；loss:-1；neutral:0；gain:+1；amplification:+2:0指的样本拷贝数的扩增或者缺失未超过该峰值区域的阈值量；±1指的是样本拷贝数的改变超过低阈值量，未超过高阈值量，属于低水平拷贝数突变；±2指的是样本拷贝数改变超过高阈值量，属于高水平拷贝数突变。在不同mRNA亚型之间，使用Pearson’schi-square检验进行统计学检验：**p0.01，*p0.05。）
结果：样本中基因增加频率依次为：MYC（81%），E2F3(55%),IRS2(49%),CCNE1(47%),EGFR(47%),NFIB(44%),CCND1(44%),和MYB(41%)，其中MYC是体细胞拷贝数增加最高频的基因；
样本中基因丢失的频率依次为：CHD1(71%),PTEN(58%),RB1(54%),和CDKN2A(43%)。
Fig2：TNBC组学特征的人口学分布
Fig2A：中国和TCGA三阴性乳腺癌队列的基因组学特征的差异。
中国队列PIK3CA突变率：18%；TCGA队列PIK3CA突变率：10%。
原因探讨：非裔美国人（5%）和中国人（18%），有统计学差异，这可能是造成差异的原因。
白种患者（13%）和中国人（18%），PIK3CA突变率无明显差异。
Fig2B:体细胞拷贝数变异的差异
中国TNBC患者在22q11有更高频率的体细胞拷贝数增加，其变异频率中位数为44%；
对应的，TCGA非裔美国人19%；TCGA白种人15%。（使用fisher检验，分别比较非裔美国人、白种人与亚洲人的体细胞拷贝数变异谱（至少包含5个连续的FDR0.1的基因，被认为差异有显著性，在图中用黑色实心△标出））。在22q11上，横跨个基因，包括5个已知的肿瘤相关的基因：BCR,MAPK1,CLTCL1,LZTR1,和SEPT5，其表达水平在拷贝数增加1/2的患者中显著提高。
Fig2C:mRNA亚型分布情况
LARsubtype占比：中国23%；TCGA非裔美国人9%；TCGA白人12%（使用fisher检验，检查在不同队列中各亚型的分布情况，*p0.05，有统计学差异）。而TCGA中的9个亚洲TNBC患者中，有3个是LARsubtype，占比(33%)。说明亚洲人的LAR占比可能高于白人。
Fig3：TNBC多组学数据分型
接着，作者基于mRNA、CNV、突变标志对纳入患者进行聚类分析。
FigureS2（A）:通过重复采样（1,次迭代）随机选择肿瘤谱对个TNBC患者的mRNA进行共识聚类（k=2-10）。
FigureS2（B）:根据肘点-斜率变化最大的点（D），选择k=4作为最佳层次聚类个数。
FigureS2（C、D）:使用非监督K-值聚类法，基于差异表达编码基因的前2个mRNA，将个肿瘤分为4个聚类。具体的聚类在正文图中细致谈及，见后文。
Fig3A:基于差异表达mRNA，将个肿瘤分为4个聚类。
(1)luminalA型（LAR,腔面雄激素受体型）：23%，特征——与雄激素受体信号途径有关；
(2)免疫调节型（IM）：24%，特征——免疫细胞和细胞因子信号途径基因高表达；
(3)基底样免疫抑制型(BLIS)：39%,特征——预后最差，上调细胞周期基因、DNA损伤修复基因；下调免疫反应基因；
(4)间质型(MES)：15%，特征——富含乳腺癌干细胞通路基因。
这些结果与Lehmann和Pietenpol定义的TNBC6个亚型有共性：basal-like(BL1andBL2)；immunomodulatory(IM)；mesenchymal(M)；mesenchymalstem–like(MSL)；LAR。在图中表示为两种分类结果具有大致的一对一的关系。
Fig3B：K-值聚类方法处理CNA峰值，得6个聚类：
CNA亚型1,高频Chr9p23扩增;
CNA亚型2,高频Chr12p13扩增;
CNA亚型3,高频Chr13q34扩增;
CNA亚型4,高频Chr20q13扩增;
CNA亚型5,高频Chr8p21缺失;
CNA亚型6,缺乏某一染色体变化特征，但是表现低染色体不稳定性(lowCIN).
补充：CIN是指从一代细胞到下一代细胞的传代过程中染色体数目或结构的一致性不能有效的维持,其主要特点为染色体数量的广泛失衡(非整倍体)和杂合性丢失(lossofheterozygosity,LOH)的增加。
Fig3C：基于突变标志，发现4个亚型:
突变亚型1,富含APOBEC相关标志2和13(APOBEC);
突变亚型2,富含同源重组缺陷相关标志3(HRD);
突变亚型3,富含钟样标志1和5(clock-like);
突变亚型4,没有明显标志(mixed).
Fig3D：为全面了解mRNA亚型与突变标志的相互关系，探究基因表达、拷贝数、突变亚型两两之间的联系。
例：85%LAR亚型被归类到lowCIN或Chr8p21del,7%LAR亚型被归类到HRD（同源重组缺陷）亚型。其他有显著对应关系的聚类依次为：BLIS—HRD,Chr9p23amp,Chr12p13amp；IM—lowCIN,HRD；MES(与其他聚类对应关系无显著特征)
FigS3A、S3B、S3C：iClusterPlus观察的结果与前面结果一致(iClusterPlus:Integrativeclusteringofmulti-typegenomicdata，多组学数据整合聚类)，支持前面的聚类结论。
iClustercluster8(iC8)几乎全部由LARsubtype组成(32/33,97%),大部分iC8属于low-CIN亚型(25/33,76%),仅有1个病例被归类到HRD亚型(1/33,3%).
在其他亚型中具有显著对应关系的有：例：Chr9p23amp（61%）和Chr12p13amp（74%）属于BLIS亚型;65%HRD亚型由BLIS亚型组成。与前面亚型之间的对应关系具有一致性。
Fig3E：基于mRNA亚型、CNA亚型、mutation亚型，对患者进行预后分析。
统计学方法：校正淋巴结状态和肿瘤大小的cox回归分析。黑圆圈代表风险度、黑线代表95%置信区间。
结论：CNA亚型、mutation亚型聚类不能可靠预测无复发生存期（RFS）。4种mRNA亚型之间没有总体差异(p=0.)。但是，IM较BLIS预后更好,有统计学差异(IMhazardratio:0.34;95%CI:0.13–0.85;p=0.).
在全面探究和描述mRNA、CNV、突变情况及它们之间相互关系后，作者继续按照mRNA亚型的分类，依次对LAR、IM、BLIS和MES亚型进行详细的探究，涉及各亚型的突变情况、CNV、通路变化、免疫细胞浸润及免疫调节分子变化等多方面。
Fig4：LAR亚型中，HER2和Cell-Cycle信号通路途径激活
Fig4A:HER2在TNBC中的比例。
左图：FUSCCTNBC中，5个LAR患者有HER2非同义突变(HER2全部发生于LAR)
右图：TCGATNBC队列中，4个LAR患者具有HER2非同义突变，2个其他类型患者具有HER2突变。
结论：LAR亚型中的HER2突变频率高于其他亚型中的HER2突变频率；
由文中得出，LAR亚型中的HER2的突变频率也高于非三阴性乳腺癌的HER2突变频率(2%innon-TNBC,p=0.).
Fig4B：HER2突变位点
注：以蛋白质参考序列描述基因突变：，V-缬氨酸、L-亮氨酸、D-天冬氨酸、Y-酪氨酸、S-丝氨酸。
结论：FUSCCTNBC队列中的5个HER2突变由以下突变组成：发生在激酶域的2个VL（错义突变）,1个DY,和1个LS。而根据临床标准的免疫组化和荧光，这5个患者都表现为HER2（-）。这其中的原因可进行进一步的探讨，可能是临床上仅能检测野生型HER2扩增有关。
突变不仅与ERBB2激活有关，而且与靶向HER2的单抗体曲妥珠单抗（trastuzumab）、作用与HER2表面受体的络氨酸激酶抑制剂拉帕替尼（lapatinib）与和先前未报道过的E_PdelinsA耐药有关。（注：曲妥珠单抗主要用于HER2扩增性的TNBC）
Fig4C:ERBB2突变致ERBB2信号通路相对激活
横坐标：根据ERBB2标志得分对患者进行排序；
纵坐标：GSVA（genesetvariationanalysis）评分
结论：携带ERBB2突变的病人展现出ERBB2信号通路的相对激活，GSVA得出ERBB2标志得分较高。
FigS4A:在mRNA亚型中，染色体的体细胞中染色体的CNV变化
结论：LAR中拷贝数变异较少，仅有Chr9p21缺失的情况较多，涉及调节细胞周期的关键基因—CDKN2A。
CDKN2A缺失/删除频率：LAR65%；其他36%（p0.01）
其他细胞周期相关基因RB1缺失较少：LAR28%；其他58%；CCND1和E2F3拷贝数增加频率较低：LAR29%;其他类型以此为46%、37%、57%。
FigS4B:使用-log10(未调整的p值)比较mRNA亚型之间的体细胞CNA
x轴上方：获得/扩增;x轴下方：丢失/缺失。
统计学指标：使用Fisher精确检验计算，至少五个p1×10-4的连续基因被认为是显著的。
结论同figS4A:Chr9p21缺失的情况较多,在mRNA各亚型间有统计学差异。
接figS4A、FigS4B，Fig4D进一步证实LAR亚型Chr9p21缺失的情况较多，CDKN2A和E2F3表达减少。左图表示的是拷贝数变异的频率；右图表示mRNA表达量。
Fig5：免疫检查点抑制剂在IM中的潜在应用
基于mRNA亚型分组，Fig5A展示瘤内或者间质内肿瘤浸润淋巴细胞平均得分。
结论：IM亚型间质和瘤内肿瘤浸润淋巴细胞得分均高于其他类型，差异有统计学意义。
同时，作者采用HE染色，也证实了间质和肿瘤内浸润淋巴细胞的积聚。
FigS4C:比较mRNA各亚型之间的体细胞突变负荷，发现IM的突变负荷并不高。
从左至右的变量依次是:Allmutations,indels（Insertion和Deletion）,singlenucleotidevariants(SNVs),nonsynonymousSNVsandsynonymousSNVs.
箱线图：盒子中间线为中位数，盒子的上下分别代表0.25和0.75分位数，延长线代表分位数大小扩大1.5倍。点代表数据对应的值。
Fig5B:作者使用GSEA分析，结果证实——IM亚型存在获得性免疫和干扰素-γ通路在IM亚型激活
Fig5C：IM亚型富含免疫激活细胞和免疫调节分子。
左图：CIBERSORT分析各亚型中淋巴细胞浸润的相对数量（当k-w检验p0.05时，进一步使用多组比较的两两比较Nemenyi检验，***p0.,**p0.01,*p0.05）
右图：各亚型中促进免疫基因表达热图分析
注：TMEM促进固有免疫，诱导1型干扰素(IFN-alphaandIFN-beta)生成，干扰素具有抗病毒、抑制细胞增殖、调节免疫及抗肿瘤作用。TNFSF13/TNFSF13B（肿瘤坏死因子超家族）、TNFRSF4/18(肿瘤死亡因子受体产超家族).CD27及CD27L,属于这一家族，促进T细胞活化、T/B细胞相互作用,有杀伤、抑制或诱导肿瘤细胞凋亡的作用。CD86与诱导剂CD28和抑制剂CTLA4相互作用，是诱导T淋巴细胞增殖及产生IL-2的主要协同因子。CD40是与促进T细胞和B细胞功能有关的一种表面抗原。B7-1/B7-2的受体是CD28,CD28是免疫促进作用；人B7-H2的受体是诱导性共刺激分子(ICOS)，该家族是重要的协同刺激分子，可促进T细胞增殖和细胞因子产生，对B细胞活化、分子和抗体产生也发挥重要调节作用。IL6可促进免疫活动。
临床数据和组学数据都证实了IM亚型中免疫细胞浸润，因此免疫逃避的机制可能包括招募免疫抑制细胞或者活化免疫检查点分子。故作者从这两方面来探讨IM亚型肿瘤免疫逃逸的机制。
Fig5D：探究mRNA各亚型的免疫抑制细胞浸润和免疫抑制分子表达，证实IM亚型肿瘤逃逸的机制可能是免疫检查点分子高表达。
左图：CIBERSORT分析各亚型中免疫抑制细胞浸润的相对数量（当k-w检验p0.05时，进一步使用多组比较的两两比较Nemenyi检验，***p0.,**p0.01,*p0.05）。结论：各亚型之间无显著差异。
右图：各亚型免疫检查点基因表达谱分析。结论：IM型免疫检查点分子过表达，尤其是IDO1（吲哚胺2,3-双加氧酶，其过表达与肿瘤细胞中的抑癌基因Bin1缺乏相关），可通过IDO1来介导免疫逃逸。
其他：HAVCR2免疫抑制型受体；CD47与肿瘤细胞上的SIRPa结合，造成免疫逃逸；ENTPD1（胞外二三磷酸核苷酸水解酶），通过腺苷介导的途径抑制免疫；CD、VICN1、CTLA4、PD-1、BTLA、LAG-3抑制性受体；IL10负性调节因子；CD(从属于B7-CD28超家族，负性调控作用)；LAG3可结合CD3/TCR复合物，从而抑制T细胞免疫。
讨论完IM亚型后，作者继续探究BLIS亚型。BLIS亚型预示TNBC患者更差的预后和缺乏免疫激活反应，不易从免疫检查点抑制剂治疗中收益，因此需要采用其他的治疗方案。因为BLIS与HRD高相关，HRD突变亚型中的65%为BLIS，故基于HRD得分，将基底样免疫抑制型（BLIS）进一步分类。
Fig6：基于HRD得分，将基底样免疫抑制型（BLIS）进一步分类。
HRD得分（Timms基于拷贝数生物标志提出）与抑癌基因BRCA1/2突变失活显著相关，便于识别从DNA损伤剂治疗中获益的患者（包括但不限于BRCA1或者BRCA2突变的携带者）
Fig6A：BLIS亚型患者具有更高的HRDscores。
在其他类型中，BRCA1或BRCA2胚系突变携带者有更高的HRDscores(p=0.)。
总的说来，无论患者是否携带BRCA突变，BLIS亚型较其他亚型总体具有更高的HRDscores，差异有统计学意义(p=0.)。
Fig6B、6C：按照中位数41.64将BLIS型患者分为两组：高HRD得分组、低HRD得分组，进行生存分析。结果提示低HRD得分组预后更差，5年无复发生存率仅为73%，为高HRDscore组为95%。并且临床数据分析提示，高HRDscoreBLIS患者复发时对放化疗敏感：在3个高HRD得分患者中，仅有1个患者在接受治疗后复发。但是她的肝转移和脑转移瘤对化疗和方法敏感，接受治疗后获得完全缓解。
Fig6D：探究造成不同BLIS亚型中高、低HRDscore组不同临床特征的生物学机制。
高HRDscore组有更多的Chr9p23和Chr13q34扩增比例(p0.).
低HRDscore组倾向于表现出整个基因组倍性变化（由ASCAT-肿瘤等位基因特异性的拷贝数分析方法得出）,其基因倍型2.7在lowHRD中的频率为51%，在highHRD中为27%，二者具有统计学差异（p=0.）
结合BLIS亚型的讨论：在BLIS亚型中，高HRDscore患者可能从基于顺铂的DNA损伤化疗方案中获益，低HRDscore患者目前没有有效的治疗方案，在复发时应该进行更多的临床试验以找到有效方法。
结合前面的研究与描述：Fig1B、1C:MES亚型驱动肿瘤发生的基因学事件，如PIK3CA突变、E2F3拷贝数增加，其发生频率居中；Fig3D：MES亚型与CNV和突变聚类的关系也居于中等频率。与其他类型相比，MES亚型的CNV、基因突变不具有代表性，所以不能使用一个特异的基因组学特征来区分其和其他亚型TNBC。故未在正文图中未单独用完整的插图描述MES亚型。
综合图+附图：MES亚型表现出乳腺癌干细胞的特征、JAK/STAT3信号通路在MES亚型上调
FigS5A：基因表达谱分析揭示MES亚型表现出乳腺癌干细胞的特征
热图：在不同mRNA亚型中乳腺癌干细胞相关基因的归一化表达值。
上半部分：乳腺癌干细胞中上调的基因;下半部分：乳腺癌干细胞中下调的基因。
因JAK/STAT3信号通路对维持乳腺癌干细胞意义重大，故探究MES亚型中该信号通路的改变。JAK，是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶（PTK）。STAT即信号传导及转录激活因子（Signaltransducersandactivatorsoftranscription）,含有SH2和SH3结构域，可与特定的含磷酸化酪氨酸的肽段结合。当STAT被磷酸化后，发生聚合成为活化的转录激活因子形式，进入胞核内与靶基因结合，促进其转录。
FigS5B：探究JAK/STAT3信号通路在各mRNA亚型中的表达，结果显示JAK1和IL6（JAK/STAT3激活的激动因子）在MES亚型中高表达。
FigS5C：在各mRNA亚型中，pSTAT通路相关基因的归一化后表达值，结果变现出MES亚型中pSTAT激活相关的基因高表达。
上半部分：激活pSTAT通路，上调的基因；下半部分：激活pSTAT通路，下调的基因。
FigS5D：进一步探究在各mRNA亚型中pSTAT3基因表达标志得分，发现MES亚型pSTAT3基因表达标志得分高，有统计学意义。
注：***p0.;**p0.01;*p0.05.
以上结论均强调了JAK/STAT3信号通路在MES亚型上调。
尽管最近的证据表明JAK1/2抑制剂ruxolitinib（鲁索替尼、JAK1和JAK2激酶抑制剂，针对BRCA突变修复）在转移性三阴性乳腺癌中疗效有限，我们的数据提示MES亚型可能会由于STAT激活，而从STAT3抑制剂中收益。
最后，Table1结合各亚型的临床特征、突变情况、拷贝数变异情况和靶向治疗进行总结，可以发现每一亚型的临床预后不同，其携带的基因突变、CNV特征各异，都有可供选择的基因靶点，预示着将来可以亚型特异性的精准治疗。
参考文献：
JiangYi-Zhou,MaDing,SuoChenetal.GenomicandTranscriptomicLandscapeofTriple-NegativeBreastCancers:SubtypesandTreatmentStrategies.[J].CancerCell,,35:-.e5.
编辑：吕琼
校审专家：朱伟良
专家介绍
朱伟良，副主任医师，医学博士，硕士研究生导师。
从事肿瘤内科专业10余年，专注各种恶性肿瘤的规范化综合治疗，尤其是在乳腺癌及小细胞肺癌等肿瘤诊治上有较深入研究。学术研究方向：肿瘤的靶向治疗及化疗耐药分子机制研究。主持及参加国家自然科学基金、广东省自然科学基金10余项，在国际及国内核心期刊以上杂志发表论文20余篇，SCI收录8篇。门诊时间：周四下午专家门诊专业方向：乳腺癌、小细胞肺癌及神经内分泌肿瘤预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇推荐文章
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