本期遗传学与整合组学课题组为大家带来的是年1月发表在Cell的“Single-CellMapofDiverseImmunePhenotypesintheBreastTumorMicroenvironment”一文，详细描绘了乳腺癌的免疫图谱，特别是体现了T细胞活化和分化状态。
一、研究背景了解肿瘤微环境中的免疫细胞表型对于理解癌症进展和免疫治疗反应的机制至关重要。因此，文章试图对各种类型的人类乳腺肿瘤以及配对的正常乳腺组织、外周血和淋巴结中的造血来源细胞进行大规模、高维度的分析。
二、简介使用单细胞RNA-seq分析了8种乳腺癌的45，个免疫细胞，以及匹配的正常乳腺组织、血液和淋巴结。尽管正常免疫细胞和肿瘤组织中的免疫细胞有显著的相似性，但观察到肿瘤微环境特异性的持续表型扩增。对另外27个T细胞的成对单细胞RNA和T细胞受体测序数据的分析揭示了克隆化对表型多样性的组合影响。结果支持T细胞持续激活的模型，与癌症中的巨噬细胞极化模型不一致。结果对表征肿瘤浸润性免疫细胞具有重要意义。
三、实验思路四、研究结果1.乳腺癌驻留免疫细胞的单细胞RNA序列分析
本文使用了未接受治疗的乳腺癌患者的CD54+细胞和正常乳腺组织、外周血和新鲜手术标本淋巴结中的CD45+细胞，使用inDrop平台对相应的荧光激活细胞分选(FACS)纯化的CD45+细胞群体进行单细胞RNA测序（图1A、1B和STAR方法)。通过验证，能够确定大多数预期的免疫细胞类型，包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞(DC)、T细胞、B细胞、肥大细胞和中性粒细胞(图1C)，能从每个单独的肿瘤中捕捉到免疫生态系统的全面表现。但文章发现每种肿瘤的免疫组成都有很大程度的差异(图1D)。如髓系和T细胞分别占4%~55%和21%~96%。我们还观察到患者间代谢特征的变化，包括缺氧(图1E)。
2.跨多个肿瘤的数据集成
为了使患者进行系统的比较，我们将数据与所有肿瘤合并。然而，我们观察到来自同一患者的细胞通常比患者相同谱系的细胞更相似（图2A）。此外，文章的分析显示肿瘤中CD8+T细胞的激活梯度，在TNBC肿瘤(BC3)中最显著。之后用Biscuit对数据进行了聚类，发现了T细胞、巨噬细胞、单核细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞群(图2C)。
3.乳腺肿瘤免疫细胞图谱显示细胞状态具有大量多样性
文章合并了所有组织和患者的数据，揭示了83个不同的集群(图2E,图2F),大多数集群在多个患者之间共有，只有10个是患者特异性的(图2G)。为了将每个簇分配到一种细胞类型，文章将簇的平均表达与分类的大数据集进行了比较(图2E和2F)，鉴定出了38个T细胞、27个骨髓系、9个B细胞和9个NK细胞簇。使用规范标记的表达对这些注释进行了确认和优化(图2H)。在T细胞簇中，我们鉴定出15个CD8+和21个CD4+簇，它们被分为9个幼稚型簇、7个中央记忆型簇、15个效应型簇和5个Treg簇。髓系簇分为3个巨噬细胞、3个肥大细胞、4个中性粒细胞、3个树突状细胞、1个浆状树突状细胞和13个单核簇。最后，我们鉴定出3个CD56-NK细胞簇和6个CD56+NK细胞簇，其中2个可能是NKT细胞(图2I和2J)
4.组织环境影响免疫表型状态的多样性
文章使用了(t-SNE)来可视化组织间的表型，显示血液和淋巴结中的T细胞与乳腺组织中的T细胞表现出不同的表型(图3A和3B)。虽然T细胞和髓系细胞在肿瘤和正常组织样本中表现出相当大的重叠，但我们观察到肿瘤中表型异质性增加，细胞群扩大(图3B)。幼稚T细胞在3个血液特异性聚集群中富集，而B细胞在淋巴结中比在其他组织中更普遍(图3C)。肿瘤和正常组织中均存在T细胞簇，但肿瘤中细胞毒性T细胞簇更丰富，Treg簇也同样丰富。与正常组织相比，肿瘤组织中基因表达的差异显著增加，导致了细胞状态多样性的增加(图3D)。我们发现变异最大的基因在肿瘤环境激活的信号通路中富集，包括I型(IFNa)和II型干扰素(IFNg)、肿瘤坏死因子(TNF-a)、转化生长因子b(TGF-b)、IL6/JAK/STAT信号以及缺氧(STAR方法)。体积变化评估显示，与正常乳腺组织相比，肿瘤中所有主要细胞类型的表型体积均显著增加，包括T细胞、髓系细胞和NK细胞(图3F)这些数据表明，肿瘤内细胞状态的异质性增加和明显的表型扩张可能是由于肿瘤内部的局部微环境更加多样化，这些微环境在炎症程度、缺氧、激活和抑制受体的配体表达以及营养供应方面存在差异。
5.瘤内T细胞存在于连续的变异成分上
虽然一些T细胞成分区分了离散的簇，但大多数成分定义了逐渐变化的趋势(图4A),变异信息最丰富的部分，标记为“激活”，与T细胞激活和进行性分化的基因信号以及IFNg信号高度相关(p=0.0)。激活信号的平均表达沿着组分稳定增加(图4B)，伴随着特异性激活相关基因表达的逐渐增加(图4C),瘤内T细胞群，包括Treg和效应记忆T细胞，在成分的激活端富集(图4A和4D)，而幼稚的外周血T细胞聚集在最低活化末端，与其静止状态一致(图4D),虽然簇的平均表达水平随着成分的变化而逐渐变化，但每个簇中有广泛的激活状态(图4D)。已知与该成分最相关的基因在激活和渐进性分化时增加，包括细胞溶解效应分子颗粒酶A和K(GZMA和GZMK)等（图4C)。变异的第二个信息量最大的成分被标记为“末端分化”(图4E)；与其相关性最强的基因包括共刺激分子(CD2、GITR、OX40和4-1BB)以及共抑制受体(CTLA-4和TIGIT)。这一组还包括FOXP3、IL2RA和ENTPD1(CD39)，这是Treg细胞的特征基因，与激活和末端分化成分最相关的基因有适度的重叠(图4A、4C)。
6.肿瘤内T细胞群具有不同的环境特征
虽然细胞群体沿着激活成分以连续的方式排列，但是当考虑到与对不同环境刺激的反应相关的特征组合时，每个群体看起来是不同的。CD4效应器和中央记忆簇(图5A)表现出不同水平的基因表达，涉及I型和II型干扰素应答、缺氧。此外，此外，CD8效应器和中央记忆簇(图5B)在激活、促炎和细胞溶解效应途径相关基因的表达水平上存在差异。这些发现表明，肿瘤内的T细胞可能暴露在不同程度的炎症、缺氧和营养缺乏的环境中。虽然这些反应中的许多(例如，激活或缺氧)单独代表表型连续体，但它们的组合可能导致更离散的状态(STAR方法)。与效应器T细胞相比，大多数Treg群体在抗炎、疲惫、缺氧和新陈代谢基因集方面具有相似的模式(图5C)。例如，CTLA-4在Treg簇46、56和87中与TIGIT和共刺激受体GITR强烈共变异；在第46和80簇中与CD27强共变；在80簇中仅与共刺激受体ICOS共变异(图5F和5G)。检查点受体之间的协方差模式在Treg簇之间通常不同(图5G)，其他重要的免疫基因显示出模块化的协方差结构，这表明共同调节和潜在的参与相似的功能模式(图5H)。由于在个别患者样本中观察到不同比例的Treg簇，在患者水平上也存在基因共表达的差异，大多数患者并不具有所有5种亚型的Treg细胞(图5i)。
7．T细胞状态由不同的TCR使用情况决定
文章观察到解释免疫细胞变异的主要成分，如激活，表现出连续性，但T细胞簇是可分离的，因为它们对与环境刺激反应相关的信号的差异表达(图5A、5B和S2B)。使用技术分析的肿瘤内T细胞也观察到类似的趋势(图6D)。当与TCR克隆型联合分析时，我们观察到每个聚类实际上由克隆型的不同组合子集组成(图6E)。此外，每种克隆型仅存在于少数相关簇中，这些簇在表型上比随机选择的簇明显更相似(p0.01星方法)，因此在SNE投影中占据了一个有限的区域(图6F)。在某些情况下，共享一个克隆型的集群表现出相似的激活水平(图6E)，而在其他情况下，这种集群在与环境刺激相关的特征上是相似的。例如，在肿瘤BC9中，克隆型9存在于簇T11和T12中，它们在几乎所有的环境特征中具有非常相似的表达水平(图6D和6E)。单个T细胞簇的可变TCR克隆型组成，以及它们关键基因表达特征的差异表达，因此表明表型状态可能是由抗原TCR刺激和环境刺激的组合形成的。
8.活化和分化解释了肿瘤内髓样细胞的变异
对BC1-8中发现的单核细胞簇的广泛研究表明，这些主要细胞类型中存在未探索的亚结构(图7A)。与T细胞一样，我们使用扩散图来评估这种异质性，不包括中性粒细胞和肥大细胞，因为它们形成了更明显的簇(图7B)。这项分析揭示了四个主要分支，显示出比T细胞更明显的细胞状态。第一分支几乎完全包含肿瘤内来自3个集群(23、25和28)的巨噬细胞(TAMs)(图7B-7F)。接下来的2个成分捕获了从血液单核细胞到肿瘤内单核细胞的更渐进的轨迹(图7B-7D和S7B-S7D)；具有两种离散状态的附加成分将浆细胞样DC(pDC)与其他单核细胞群区分开来(图7B、7E)。聚焦于第一个分支，最重要的相关基因包括APOE、CD68、TREM2和CHIT1。这可能反映了募集的或驻留在组织中的巨噬细胞的分化和活化。此外，与“交替激活的”(M2)巨噬细胞相关的基因表达，包括清道夫受体MARCO、促血管生成受体NRP2和抑制分子B7-H3(CD)，沿该分支增加(图S7B)。与此同时，与“经典激活的”(M1)巨噬细胞相关的免疫刺激基因，包括趋化因子CCL3(MIP-1a)，沿着分支增加。所有3个TAM群体，特别是聚类23和28，都是单核细胞聚类中典型M2特征表达最高的，但在M1特征中也同样高。非常引人注目的是，我们发现M1和M2基因信号在髓系人群中呈正相关(图7G)，与最近在其他肿瘤类型中的发现一致。这些发现支持了肿瘤微环境中巨噬细胞活化不符合极化模型的观点，无论是作为离散状态还是沿着一系列交替极化轨迹。类似地，细胞，协变参数在区分3个TAM群体时是困难的，尽管它们共享大多数差异表达的基因。一个例子是两个M2类型标记的共同表达，马可和B7-H3。虽然TAM簇都表达高水平的两种基因，但是它们在簇23和25中共同正变化，但是在28中呈负变化。
五、总结与展望文章不仅对乳腺肿瘤微环境中免疫细胞整体进行了分析，还对不同种类的细胞及其亚群进行了详细的概述，以及由此产生的广泛的免疫单细胞RNA-和TCR-seq数据集和全面的分析平台，将有助于理解免疫细胞促进和阻止肿瘤进展的潜在机制。
文献分享者：李昊
原文引用：
doi:10./j.cell..05.
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